Tóm tắt
Cho đến nay, đã có sự tập trung đáng kể vào việc xác định các mục tiêu sinh học ở tuyến trùng để phát triển các tác nhân kiểm soát. Sự can thiệp RNA cho phép xác định liệu một gen cụ thể có cần thiết cho sự phát triển hay tồn tại hay không và có tiềm năng như một kỹ thuật sàng lọc thông lượng cao các gen để tìm ra các tác động có hại. Kỹ thuật RNAi đã được áp dụng cho tuyến trùng ký sinh với mức độ thành công khác nhau. Dự án này nhằm mô tả đặc điểm con đường của RNAi ở tuyến trùng ký sinh Haemonchus contortus so với con đường đã được xác định bởi các nghiên cứu ở Caenorhabditis elegans.
Phương pháp tiếp cận tin sinh học liên tục đã được sử dụng trong toàn bộ dự án khi trình tự H. contortus mới được phát hành vào phạm vi công cộng. Giải trình tự Roche 454-Titanium thế hệ tiếp theo của xL3 và tuyến trùng trưởng thành đã được đưa vào dự án như một sản phẩm bổ sung và cung cấp rất nhiều dữ liệu chất lượng rất cao về H. contortus. Tất cả trình tự H. contortus có sẵn (cả nội bộ và công khai) đã được thu thập và biên soạn thành cơ sở dữ liệu có thể tìm kiếm được. Cơ sở dữ liệu này sau đó được truy vấn bằng cách sử dụng nhiều tham số khác nhau nhằm cố gắng tăng thông tin trình tự có sẵn để chỉnh hình các phân tử liên quan đến cơ chế RNAi. Thông tin trình tự đáng chú ý đã thu được của mười gen này (sid-1, dcr-1, drh-1, eri-1, pir-1, rsd-3, rrf-1, rde-1, rrf-3 và ego-1). Không thu được thông tin trình tự đối với hai gen (rsd-6 và rde-4), dường như không có mặt. Tuy nhiên, trình tự đã được xác định cho một họ protein argonaute có thể có; những thứ này có thể hoàn thành vai trò chức năng của các chỉnh hình C. Elegans còn thiếu. Một lượng nhỏ trình tự đã được xác định cho sid-2 khó nắm bắt, gen này có vẻ khá khác nhau và cực kỳ khó tìm. Các đoạn mồi được thiết kế cho bảy gen trong số này (sid-1, dcr-1, eri-1, pir-1, rsd-3, rde-1 và ego-1), mỗi gen đại diện cho một nhánh xử lý khác nhau trong cơ chế RNAi. Những đoạn mồi này được thiết kế để khuếch đại một vùng mã hóa nhỏ được bảo tồn cho mỗi gen và được sử dụng để tạo ra hồ sơ biểu hiện và hồ sơ bản địa hóa theo giai đoạn cụ thể bằng phương pháp PCR định lượng. Tất cả các gen được biểu hiện trong vòng đời của ký sinh trùng với các biến thể về cấu hình biểu hiện. Điều này cung cấp bằng chứng cho thấy cơ chế RNAi hoạt động ở H. contortus, mặc dù nó khác với C. Elegans. Cần lưu ý rằng thư viện trình tự được biên soạn cung cấp nguồn tài nguyên chiến lược sẽ mang lại lợi ích cho nỗ lực khám phá tuyến trùng ký sinh và có thể cho phép xác định các mục tiêu thuốc/vacxin mới trong các dự án trong tương lai.
Xét nghiệm RNAi ban đầu được phát triển trong Dự án AHW.031 của chúng tôi đã sớm được cải thiện đáng kể trong Dự án WP166. Xét nghiệm RNAi cải tiến này đã được sử dụng trong dự án này để mô tả đặc tính chức năng chi tiết của sáu gen, Nov0374, Nov0491, S3_0055, S1_452, ben-1 và ubq-1. Những gen này được biểu hiện ở tất cả các giai đoạn của vòng đời được xác định bằng phương pháp PCR định lượng. Không quan sát thấy kiểu hình RNAi trong Nov0374 và chỉ có tỷ lệ tử vong nhẹ ở L1 đối với ubq-1. Một sự ngừng phát triển kịch tính hơn đã được quan sát thấy đối với ben-1 và S3_0055 với khoảng 20% số L1 bị bệnh ở ngày thứ 4 và 20% số L1 bị bệnh và 20% số L2 bị bệnh vào ngày thứ 8. Nov0491 đã tăng tỷ lệ tử vong ở L1 và L2, trong khi S1-452 bị ngừng phát triển ở L2 với 40% vào ngày thứ 8. Các thí nghiệm lai tạo tại chỗ đã được thực hiện để xác định cấu hình nội địa hóa của các gen này. Các kiểu làm im lặng gen khác biệt không tương quan với việc định vị các bản phiên mã mRNA có sẵn cho mỗi gen. Ngoài ra, sự biến đổi của việc làm im lặng gen bằng RNAi ở H. contortus có thể là do tốc độ luân chuyển protein thay đổi đối với các mục tiêu đã chọn. Cần phải nghiên cứu sâu hơn để điều tra khả năng này.
